Mechanismen der lichtinduzierten Freisetzung von Abgangsgruppen aus 2-Nitrobenzylverbindungen

Photolabile Schutzgruppen werden in der pr�parativen organischen und kombinatorischen Synthese, der Photolithographie und der Biochemie h�ufig verwendet. Die Besonderheit dieser Schutzgruppen ist, dass sie ohne Erw�rmung und ohne Reagenzien einfach durch Photolyse abgespalten werden k�nnen. Biologisch aktive Verbindungen (Wirkstoffe) k�nnen durch Bindung an eine solche Schutzgruppe in eine biologisch inaktive Form �berf�hrt werden (die inaktiven Verbindungen nennt man auch ãCaged CompoundsÒ). Mit Hilfe der Lasertechnik ist es m�glich, durch Bestrahlung die biologisch inaktiven Verbindungen gezielt an ihrem Wirkungsort in k�rzester Zeit wieder in ihre aktive Form zu transformieren. Dies er�ffnet den photolabilen Schutzgruppen ein breites Anwendungsgebiet in der biologischen Grundlagenforschung. Mit den oben genannten Eigenschaften ist es m�glich, schnelle, durch Wirkstoffe induzierte Prozesse in physiologischer Umgebung zu beobachten, beispielsweise bei der Untersuchung der Substratbindung von Enzymen, der Elementarschritte einer Proteinfaltung, der lichtaktivierten Gen-Expression und der Potential�nderung von Nervenzellen. Trotz der Anwendung von photolabilen 2-Nitrobenzyl-Schutzgruppen seit �ber drei Jahrzehnten ist erstaunlich wenig �ber die Mechanismen bekannt, die letztendlich zur Abspaltung der Schutzgruppen f�hren. Zielsetzung dieser Arbeit war es, diese Mechanismen im Detail zu untersuchen. Zu den wichtigsten experimentellen Methoden f�r diese Aufgabenstellung z�hlt die Blitzlichtphotolyse. Mit einem kurzzeitigen Laserpuls wird die in L�sung vorliegende Verbindung bestrahlt und die dadurch verursachten Änderungen des UV/Vis- bzw. IRSpektrums als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Damit erh�lt man Informationen �ber Spektren und Kinetiken kurzlebiger Intermediate, womit man auf deren Struktur und Reaktivit�t schliessen kann. Um eine �bersicht �ber alle Elementarreaktionen zu gewinnen, die zur Freisetzung der gesch�tzten Abgangsgruppe f�hren, wurden mehrere Modellverbindungen untersucht. Im ersten Teil werden photoinduzierte Reaktionen von 2-Nitrobenzylverbindungen ohne Abgangsgruppe beschrieben, um sie mit den Abspaltungsreaktionen von photolabilen 2- Nitrobenzyl-Schutzgruppen zu vergleichen. Der zweite Teil befasst sich mit den Mechanismen der Schutzgruppenabspaltung von photolabilen 2-Nitrobenzyletherderivaten und NPE-Caged APT. Allen in dieser Arbeit untersuchten 2-Nitrobenzylderivaten ist die photochemische Bildung des aci-Nitro-Tautomers gemeinsam, das in Abh�ngigkeit von der Substitution der 2- Nitrobenzylgruppe und dem verwendeten L�sungsmittel unterschiedliche Reaktivit�ten zeigt. Die aus einer 2-Nitrobenzylverbindung resultierende aci-Nitrogruppe ist eine schwache S�ure (pKa = 3Ð5), die in w�ssriger L�sung im Gleichgewicht mit dem Anion vorliegt. Dies ist insbesondere dann wichtig, wenn das Anion eine geringere Reaktivit�t aufweist und zu anderen Produkten f�hrt als das neutrale aci-Nitro-Tautomer. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass dieses Gleichgewicht eine zentrale Rolle in den Reaktionsmechanismen spielt. In stark saurer L�sung f�hrt eine Protonierung des aci-Nitro-Tautomers zu einem reaktiven Kation, das �ber ein Nitrosohydrat-Intermediat zum Nitrosoderivat reagiert. Die Elementarreaktionen der Retautomerisierung von aci-Nitrotoluol (aci-1) wurden f�r einen Vergleich mit den Abspaltungsreaktionen von 2-Nitrobenzyl-Schutzgruppen untersucht. In w�ssriger L�sung ist die Protonierung des Anions von 2-Nitrotoluol (1Ð) die Elementarreaktion der Retautomerisierung mit beobachteten Geschwindigkeitskonstanten von 1Ð36 sÐ1. Diese Reaktion muss prinzipiell bei allen aci-Nitro-Tautomeren in Betracht gezogen werden. Die langsame Retautomerisierung kann also als Benchmark betrachtet werden, mit der die Abspaltungsreaktionen von photolabilen 2-Nitrobenzyl-Schutzgruppen konkurrieren m�ssen. Das vorgelagerte Protonierungsgleichgewicht aci-1 1Ð begrenzt die Geschwindigkeit der Retautomerisierung von 1Ð in saurer w�ssriger L�sung (pH < 4). Anhand der bestimmten Acidit�tskonstanten von 2-Nitrotoluol (1) und aci-Nitrotoluol (aci-1) konnte die Tautomerisierungskonstante pKT = 17.0 von 1 aci-1 in w�ssriger L�sung bestimmt werden. In stark saurer w�ssriger L�sung (pH < 0) wurde eine bislang in der Literatur nicht dokumentierte, irreversible Reaktion von aci-1 entdeckt, die �ber das Nitrosohydrat 2 zu dem Produkt 2-Nitrosobenzylalkohol (3) f�hrt. Die photochemisch induzierten Reaktionen von 1-Ethyl-2-nitrobenzol (4) weisen im Vergleich zu denen von 2-Nitrotoluol (1) erhebliche Unterschiede auf. Die Quantenausbeute der Bildung des aci-Nitro-Tautomers aci-4 ist ca. 50 ´ gr�sser, die aci-Nitro-Zerfallskinetiken sind biexponentiell. Das Auftreten zweier aci-Nitro-Tautomere ist durch die E/Z-Isomerie der C=C~CH3-Gruppe bedingt. In stark saurer L�sung reagiert aci-4 (analog zu aci-1) �ber das Nitrosohydrat 7 zum Produkt 8. Aus den Produktspektren und L�sungsmittelisotopeneffekten ging hervor, dass aci-4 bzw. 4Ð (im Gegensatz zu 1Ð) in w�ssriger L�sung nicht mehr zum Edukt 4 zur�ckreagieren. Je nach L�sungsmittel und pH-Wert wurde entweder der Nitrosoaromat 8 oder 3-Methylanthranil (6) als Produkt identifiziert. Die Cyclisierung von aci-4 zu dem bicyclischen Intermediat 5 muss demnach schneller sein als eine Retautomerisierung von aci-4 bzw. 4Ð. Aus 2-Nitrobenzylalkohol (9) wird photochemisch das aci-Nitro-Tautomer aci-9 gebildet, dessen bislang bekannter konventioneller Reaktionsweg �ber das bicyclische Intermediat 10 zu 2-Nitrosobenzaldehyd (13) f�hrt. Die UV/Vis- und IR-Spektren sowie die Zerfallskinetiken der kurzlebigen Intermediate aci-9 , 10, 11 und 12 konnten detektiert werden. In dieser Arbeit wurde ein neuer Reaktionspfad entdeckt. Alternativ zur Cyclisierung f�hrt ein (je nach L�sungsmittel intramolekularer) Protonentransfer von aci-9 zu dem Nitrosohydrat 12, das unter Dehydratisierung zur Nitrosoverbindung 13 zerf�llt. Der Reaktionspfad �ber das Nitrosohydrat 12 dominiert in Hexan, Acetonitril sowie in saurer und basischer w�ssriger L�sung, der konventionelle Reaktionspfad �ber das bicyclische Intermediat 10 hingegen dominiert in neutraler w�ssriger L�sung. Es konnte weiter gezeigt werden, dass das bicyclische Intermediat 10 nicht direkt zum Produkt 13 reagiert, sondern zu dem Carbonylhydrat 11, das dann langsam zum Aldehyd 13 dehydratisiert. Dieser Mechanismus spielt bei einem speziellen Typ von Caged Compounds eine Rolle, den sogenannten ãNITR"-Verbindungen, die unter Bestrahlung Ca2+ freisetzen. Auch folgender Aspekt macht diese Reaktionen interessant: Die Hydrate 11 und (die bislang kaum untersuchten und nur schwer zug�nglichen Nitrosohydrate wie z. B.) 12 lassen sich auf einfache Weise aus 9 blitzlichtphotolytisch erzeugen und spektroskopisch beobachten. Damit ist eine einfache M�glichkeit zur Untersuchung dieser kurzlebigen Intermediate gegeben. Teil 2: Die Mechanismen der photoinduzierten Schutzgruppenabspaltung von NPE-Caged ATP (14) und 1-Methoxymethyl-2-nitrobenzol (17) wurden untersucht. Als wichtigstes Resultat wurde die in der Literatur weitl�ufig akzeptierte Annahme widerlegt, dass die leicht detektierbare Zerfallsgeschwindigkeit des aci-Nitro-Tautomers stets der Abspaltungsgeschwindigkeit der Schutzgruppe gleichgesetzt werden kann. Basierend auf dieser Annahme wurden Freisetzungsgeschwindigkeiten von Wirkstoffen anhand der beobachteten aci-Nitro- Zerfallsgeschwindigkeiten publiziert, ohne die effektive Freisetzungsgeschwindigkeit verifiziert zu haben. Dies kann zu einer fehlerhaften Interpretation der experimentellen Daten f�hren. NPE-Caged ATP Die Untersuchung des photolytisch induzierten Abspaltungsmechanismus von NPE-Caged ATP (14) hatte eine Revision des allgemein anerkannten Mechanismus nach Trentham et al. zur Folge. Die in dieser Arbeit erhaltenen pH-Reaktionsgeschwindigkeitsprofile und kinetischen Isotopeneffekte des Zerfalls von aci-14 und der Bildung von 16 waren nicht konsistent mit diesem Mechanismus. Die S�urekatalye ist nicht durch eine Phosphat- Protonierung bedingt, wie von Trentham vorgeschlagen, sondern durch ein vorgelagertes Protonierungsgleichgewicht des aci-Nitro-Tautomers aci-14 aci-14Ð. Die Sequenz aci-14 ® 15 ® 16 konnte mit der Blitzlichtphotolyse beobachtet werden und widerspricht damit dem von Trentham postulierten schnellen Gleichgewicht aci-14 15. Im pH-Bereich < 6 ist die Ring�ffnung des bicyclischen Intermediats 15 geschwindigkeitsbestimmend f�r die Freisetzung von ATP, nicht der Zerfall des aci-Nitro-Intermediats aci-14. 1-Methoxymethyl-2-nitrobenzol (17) wurde als Modellverbindung f�r 2-Nitrobenzylgesch �tze Hydroxyverbindungen untersucht. Anhand der Blitzlichtphotolyse und der zeitaufgel�sten FTÐIR-Spektroskopie konnten 5 Intermediate beobachtet werden: zwei Z/EIsomere des aci-Nitro-Tautomers aci-17, zwei syn/anti-Isomere des bicyclischen Intermediats 18 und das Halbacetal-Intermediat 19. Das bicyclische Intermediat 18 wurde erstmals in L�sung nachgewiesen, auch konnten die Zerfallskinetiken der Intermediate aci-17, 18 und 19 gemessen werden. Ein von Corrie et al. formulierter Mechanismus muss nun revidiert werden. Essentiell f�r die Abspaltungsreaktion ist die Zerfallsgeschwindigkeit des Halbacetals 19, im pH-Bereich < 8 limitiert der Halbacetalzerfall als langsamste Reaktion die Freisetzungsgeschwindigkeit des Alkohols. Je nach pH-Wert unterscheiden sich die Reaktionsgeschwindigkeiten des aci-Tautomer-Zerfalls und der Freisetzung der gesch�tzten Verbindung um bis zu 7 Gr�ssenordnungen. 2-Nitrobenzylether sind damit auch geeignete Precursor zur Erzeugung und zeitaufgel�sten Beobachtung von Halbacetalen mittels Blitzlichtphotolyse

Constraint-Based Automatic SBST Generation for RISC-V Processor Families

Software-Based Self-Tests (SBST) allow at-speed, native online-testing of processors by running software programs on the processor core, requiring no Design for Testability (DfT) infrastructure. The creation of such SBST programs often requires time-consuming manual labour that is expensive and requires in-depth knowledge of the processor’s architecture to target hard-to-test faults. In contrast, encoding the SBST generation task as a Bounded Model Checking (BMC) problem allows using sophisticated, state-of-the-art BMC solvers to automatically generate an SBST. Constraints for the BMC problem are encoded in a circuit called Validity Checker Module (VCM) and applied during SBST generation.In this paper, we focus on presenting a VCM architecture and a constraint set that allows building SBSTs that make minimal assumptions about the firmware, targeting hard-to-test faults in the ALU and register file of multiple scalar, in-order RISC-V processor families. The VCM architecture consists of a processor-specific mapping layer and a generic constraint set connected via a well-defined interface. The generic constraint set enforces the desired SBST behaviour, including controlling the processor’s pipeline state, memory accesses, and with that executed instructions, register state, and fault propagations. Using a generic constraint set allows for rapid SBST generation targeting new RISC-V processor families while keeping the generic constraints untouched. Lastly, we evaluate this approach on two RISC-V processor families, namely the DarkRISCV and a proprietary, industrial core showing the portability and strength of the approach, allowing for rapidly targeting new processors

Automatic identification of relevant chemical compounds from patents

In commercial research and development projects, public disclosure of new chemical compounds often takes place in patents. Only a small proportion of these compounds are published in journals, usually a few years after the patent. Patent authorities make available the patents but do not provide systematic continuous chemical annotations. Content databases such as Elsevier’s Reaxys provide such services mostly based on manual excerptions, which are time-consuming and costly. Automatic text-mining approaches help overcome some of the limitations of the manual process. Different text-mining approaches exist to extract chemical entities from patents. The majority of them have been developed using sub-sections of patent documents and focus on mentions of compounds. Less attention has been given to relevancy of a compound in a patent. Relevancy of a compound to a patent is based on the patent’s context. A relevant compound plays a major role within a patent. Identification of relevant compounds reduces the size of the extracted data and improves the usefulness of patent resources (e.g. supports identifying the main compounds). Annotators of databases like Reaxys only annotate relevant compounds. In this study, we design an automated system that extracts chemical entities from patents and classifies their relevance. The goldstandard set contained 18 789 chemical entity annotations. Of these, 10% were relevant compounds, 88% were irrelevant and 2% were equivocal. Our compound recognition system was based on proprietary tools. The performance (F-score) of the system on compound recognition was 84% on the development set and 86% on the test set. The relevancy classification system had an F-score of 86% on the development set and 82% on the test set. Our system can extract chemical compounds from patents and classify their relevance with high performance. This enables the extension of the Reaxys database by means of automation